Вот например, возьмем вот такую последовательность белка - не очень большую, всего 499 аминокислот. Каждая аминокислота в таком способе описания обозначается однобуквенным кодом. Предположим, что мы ничего не знаем об этом белке. Что мы можем о нем сказать?
Во-первых, аминокислоты отличаются по сродству с водой - гидрофильности или гидрофобности. Как это определяется? Если взять половину пробирки с водой, а половину, например, с гексаном, и добавить туда эту аминокислоту (точнее, некоторую ее производную) и хорошо разболтать, часть аминокислоты уйдет в гексан, а часть - в воду. Соотношение, сколько уйдет в гексан, а сколько в воду, специфично для данной аминокислоты. Для разных аминокислот оно может варьировать от 10000:1 до 1:10000.
Соответственно, каждой аминокислоте можно присвоить число, равное логарифму его распределению между гексаном и водой. Очень гидрофобная аминокислота будет иметь оценку 4 (даже 4.5), а очень гидрофильная (-4.5). Давайте обозначим все гидрофобные аминокислоты желтым цветом.
Обратим внимание, что есть участки, где гифрофобные аминокислоты идут почти сплошняком.
Попробуем построить график, где N-ной аминокислоте будет присвоено число, равное сумме гидрофобностей ее соседей, например, от N-9 до N+9. На таком графике хорошо будут видны участки высокой гидрофобности.
На графике отчетливо видно, что белок содержит 6 таких гидрофобных участков (я их обозначил красным), и еще один не очень гидрофобный, о котором мы поговорим позже.
Такое устройство говорит о том, что молекула белка находится внутри биологической мембраны и пересекает ее 6 раз, то есть имеет 6 трансмембранных участков. Специальных сигналов, которые бы вели в ядро или в митохондрию, здесь нет (есть программы, которые умеют их искать), так что, скорее всего, речь идет о клеточной мембране. Отсутствует и сигнальная последовательность в начале белка, значит начало (N-конец) находится внутри клетки. Значит, мы можем сказать и о топологии белка: он 6 раз пересекает мембраны, причем оба его конца располагаются внутри клетки.
Такая топология подтверждается и тем, что между первым и вторым трансмембранным участком находится последовательность -NST- , а про такую последовательность мы знаем, что она с большой вероятностью гликозилируется, то есть к аминокислоте N (аспарагину) присоединяется ветвистый сахар, делающий этот участок еще более гидрофильным. Такая гликозиляция бывает только с внешней стороны клетки (ну, или внутри эндоплазматического ретикулума, что топологически означает то же самое), и, соответственно, такая последовательность почти всегда бывает только с внешней стороны клетки.
Заметим еще интересную деталь. Четвертый трансмембранный участок необычный. Гидрофобные аминокислоты чередуются в нем с очень гидрофильными, причем не просто гидрофильными, а такими, которые в растворе заряжены положительно - R и K (аргинином и лизином). Таким образом, этот участок, с одной стороны, достаточно гидрофобный, чтобы находиться внутри мембраны, а с другой - имеет общий положительный заряд. В зависимости от разности потенциалов на мембране он будет перемещаться в соответствующую сторону.
Таким образом, общая топология выглядит вот так.
Обратим внимание на впячивание между 5 и 6 трансмембранным участком - это тот самый не очень гидрофобный участок, о котором я пообещал поговорить позже. В действительности, конечно, трансмембранные участки не вытянуты в линию, а имеют некоторую трехмерную структуру, причем в структуре участвуют 4 таких молекулы.
Тут, наверное, пришло время раскрыть карты и рассказать, что это за белок. Это - voltage-gated ионный канал. Даже более того, калиевый канал. Если бы мы этого не знали, мы бы узнали из последовательносты -GYG- как раз в середине слегка гидрофобной структуры, о которой я пообещал поговорить, тут пришло время назвать ее по имени - порой.
Пора калиевого канала специфична и пропускает только ионы калия с избирательностью примерно 1:50. Бывают еще натриевые и кальциевые каналы с похожей структурой, бывают и каналы с низкой избирательностью.
Они устроены очень похоже, только в калиевом канале, как я сказал, объединяются 4 разных молекулы, а в натриевом и кальциевом все 4 молекулы объединены в одны большую белковую молекулу.
Как можно проверить, что белок - калиевый канал? Есть много разных методов, один из них, старый, но по-прежнему популярный, вот какой.
Берется большая клетка диаметром примерно 1 мм - икринка лягушки Xenopus laevis. Берется ДНК, кодирующая соответствующий белок, и в пробирке делается мРНК. Тоненьким капилляром внутрь икринки впрыскивается мРНК, и клетка начинает производить белок. Посколькы белок мембранный, он попадает туда, куда должен попасть - в мембрану клетки.
Через несколько дней белка становится много. Теперь можно воткнуть в икринку два микроэлектрода - один для создания соответствующей разности потенциалов на мембране, а другой - для измерения текущего через мембрану тока. Как я уже говорил, калиевый канал специфичен только для калия, так что ток будет течь только в присутствии во внешней среде калия.
Его вольт-амперная характетистика будет выглядеть так. Начиная с некоторого напряжения - разного для разных каналов - канал открыт и пропускает ток (разумеется, в присутствии калия). А ниже него - закрыт.
Как мы уже писали, этот эффект достигается за счет 4 трансмембранного участка, который содержит положительно заряженные аминокислоты. В зависимости от напряжения на мембране этот участок перемещается и открывает или закрывает пору.
Обратим внимание, что после того, как канал откроется, он не будет открытым вечно. Через некоторое время он закроется. В некотором месте молекулы канала - в данном случае на N-конце, есть структура, которая называется мячик, которая болтается на более или менее длинной привязи. Болтаясь, она рано или поздно влезает в открытый канал и затыкает его, до тех пор, пока не снимется напряжение и сенсор напряжения не вернется на место. Для разных каналов время затыкания разное. Оно может зависеть еще от других белков, так что, например, если экспрессировать соответствующий канал в ооците ксенопуса, он вообще не будет затыкаться, пока там не будет еще другого белка.
Позвольте, скажете вы. Ведь ион натрия и кальция меньше иона калия. Как же может быть дырка - пора - которая пропускает большой ион и не пропускает маленький? Вопрос правильный. Пора - это не дырка. Ион в воде окружен большой шубой из воды, вместе с этой шубой его размер в несколько раз больше, чем без шубы. В поре ион взаимодействиет с аминокислотами, составляющими пору, и они заменяют собой молекулу воды. Для того, чтобы это делать, ион должен строго соответствовать размеру поры, иначе ему не удастся одновременно взаимодействовать с несколькими аминокислотами поры и избавиться от своей водяной шубу. Перебравшись через пору, ион снова одевается в водяную шыбу, уже по другую сторону мембраны.
Продолжение, бли недер, следует.
